Описание
Петрифильм Petrifilm Coliform Count (СС) содержит в качестве питательной основы среду VRB (кристаллический фиолетовый с желчью), в которой вместо агара используется водорастворимый гель. Гель активируется при добавлении воды и застывает при комнатной температуре. Тетразолиевый индикатор облегчает подсчет колоний на петрифильме. Верхняя пленка задерживает газ, образующийся в ходе ферментации лактозы колиформными бактериями. 

В соответствии со стандартами АОАС International  и U.S. FDA Bacteriological Analytical Manual (ВАМ) (Руководство по бактериологии) колиформными бактериями являются грамотрицательные палочки, которые ферментируют лактозу с образованием кислоты и газа. Колиформные бактерии при росте на среде образуют кислоту, что вызывает изменение цвета рН индикатора и приводит к потемнению исходного цвета геля петрифильма. Наличие пузырьков газа вокруг красных колоний подтверждает их принадлежность к колиформным бактериям.

В соответствии со стандартом ISO колиформные бактерии определяются по их способности к росту на специальных селективных средах. Метод ISO 4832 для подсчета колиформных бактерий определяет колиформы по их способности к образованию кислоты на VRB-агаре с лактозой (VRBL). На петрифильмах Petrifilm (CC) колиформы, образующие кислоту, обнаруживаются по красным колониям с газом или без газа. Метод ISO 4831 для подсчета колиформных бактерий методом НВЧ (наиболее вероятных чисел) определяет колиформы по их способности образовывать газ из лактозы на селективном бульоне. На петрифильмах Petrifilm (CC) колиформы образуют красные колонии с газом. Организация AFNOR утвердила использование петрифильмов Petrifilm (CC) в сравнении со стандартами ISO 4831 и 4832 для определения общего количества колиформных бактерий. Организация AFNOR также утвердила Petrifilm (CC) в сравнении со стандартом NF V08-017 для подсчета термотолерантных бактерий.

Область применения
Петрифильмы 3M Petrifilm Coliform Count Plate (СС) используются для количественного определения колиформных бактерий в образцах продуктов и напитках. Петрифильмы также удобно использовать для мониторинга окружающей среды. Время исследования составляет 24 часа. Петрифильмы снижают трудозатраты и дают возможность проводить более частый мониторинг в критических контрольных точках на производстве, обеспечивая лучший контроль и более высокое качество выпускаемой продукции. 

Хранение и утилизация
Хранить невскрытые упаковки с петрифильмами следует в холодильнике при температуре 2-8°C. Перед открытием упаковки с петрифильмами следует подождать, чтобы  упаковка нагрелась до комнатной температуры. Неиспользованные петрифильмы поместить обратно в упаковку. Чтобы предотвратить контакт с влагой, не хранить открытые упаковки с петрифильмами в холодильнике. Хранить вновь запечатанные упаковки в сухом прохладном месте в течение не более одного месяца. Нахождение вскрытых упаковок петрифильмов при температуре более 25°C и/или относительной влажности свыше 50% может повлиять на их качество. Не используйте петрифильмы, на которых заметны следы обесцвечивания. Срок годности и номер партии указаны на каждой упаковке петрифильмов. Как и все системы для тестирования микроорганизмов, петрифильмы после использования могут содержать жизнеспособные бактерии. Следуйте стандартным методам инактивации и утилизации биологического материала.

Инструкция по использованию

Подготовка образца

 1. Для разбавления образца использовать 0,1% пептонную воду, забуференную пептонную воду, физиологический раствор или дистиллированную воду. 
Не использовать буферные растворы, содержащие цитрат, бисульфит или тиосульфат, т.к. эти соединения могут ингибировать рост бактерий.

 2. Смешать и гомогенизировать образец.

3. Для оптимального роста бактерий довести рН разведенного образца до 6,6-7,2. Для коррекции рН кислых образцов используйте 1 н. NaOH. pH щелочных образцов довести с помощью 1 н. HCl.

Внесение образца
1. Поместить петрифильм Coliform Count Plate (СС) на ровную поверхность.
2. Поднять верхнюю пленку и внести 1 мл образца (или его разведения) на поверхность питательной подложки (в центр) петрифильма Coliform Count Plate (СС).
3. Прокатить верхней пленкой на образец. Избегать захвата пузырьков воздуха.
4. Сразу же поместить пластиковый распределитель в центр петрифильма ровной стороной вниз. Мягко надавить на центр, для распределения образца. Не перемещать и не крутить распределителем по пленке петрифильма!
5. Убрать распределитель и оставить петрифильм на одну минуту для затвердевания геля. 

Инкубация
Инкубировать петрифильмы в горизонтальном положении прозрачной стороной вверх. Петрифильмы можно группировать в количестве не более 20 штук. Инкубировать петрифильмы в течение (24±2) часов при (37±1)°C. Установить емкость с водой для создания повышенной влажности в термостате.

Интерпретация
1. Количество колоний на петрифильмах можно учесть автоматически с помощью Petrifilm Plate Reader (PPR), стандартного счетчика колоний или другого подсвечиваемого увеличителя. Подсчитать количество красных колоний с газом или без газа, независимо от их размера и интенсивности окраски. Зона роста составляет примерно 20 см². Не учитывайте колонии, которые образуются на пенопластовом ограничителе, т.к. они не находятся в селективных условиях.

2. Можно проводить учет колоний на петрифильмах, если их численность превышает 150 колоний. В этом случае подсчитывают количество колоний в одном или более репрезентативных квадратах и определяют среднее количество колоний в квадрате. Умножив среднее количество колоний на 20, получают число колоний на петрифильме.

3. Если количество колоний для подсчета слишком большое, то может образовываться много мелких колоний или много пузырьков газа, а также происходит сильное потемнение цвета геля. При большой концентрации колоний на петрифильме может происходить окрашивание всей зоны роста в темно красный цвет. В этом случае необходимо приготовить разведение образца для получения более точного результата.

4. При необходимости колонии можно изолировать для дальнейшей идентификации. Для этого следует поднять верхнюю пленку и извлечь колонию из геля. Идентифицировать колонию с использованием стандартных методов.

5. По окончании инкубации петрифильмы можно хранить в морозильнике в течение одной недели при температуре (-15C°) для последующего учета. Проводится в тех случаях, когда нет возможности учесть численность сразу после инкубации.

Интерпретация результатов

3М Petrifilm Coliform Count Plate – 
Петрифильм для определения колиформных бактерий

Петрифильм Petrifilm Coliform Count (СС) содержит в качестве питательной основы среду VRB (кристаллический фиолетовый с желчью), в которой вместо агара используется водорастворимый гель. Гель активируется при добавлении воды и застывает при комнатной температуре. Тетразолиевый индикатор облегчает подсчет колоний на петрифильме. Верхняя пленка задерживает газ, образующийся в ходе ферментации лактозы колиформными бактериями.

В соответствии со стандартами АОАС International  и U.S. FDA Bacteriological Analytical Manual (ВАМ) (Руководство по бактериологии) колиформными бактериями являются грамотрицательные палочки, которые ферментируют лактозу с образованием кислоты и газа. Колиформные бактерии при росте на среде образуют кислоту, что вызывает изменение цвета рН индикатора и приводит к потемнению исходного цвета геля петрифильма. Наличие пузырьков газа вокруг красных колоний подтверждает их принадлежность к колиформным бактериям.

Рис. 1. Количество колиформных бактерий = 69 
Определение колиформных бактерий может отличаться в разных стандартах. В соответствии со стандартом АОАС колиформные бактерии – красные колонии с газом. 

3М Petrifilm Coliform Count (СС)

 

Рис.2. Отсутствие роста = 0 
Отметьте изменения в цвете геля на Рис.2-5. Цвет геля становиться более темным по мере увеличения численности колиформных бактерий. Наличие в геле мелких пузырьков газа , несвязанных с колониями, является особенностью среды, а не результатом роста колиформных бактерий. 

Рис.3. Количество колиформных бактерий = 79 
Диапазон учета на петрифильме (СС) составляет 15-150 колоний. Не учитывайте колонии, которые образуются на пенопластовом ограничителе, т.к. они не находятся в селективных условиях. 

 

Рис.4. Вычисленное количество = 220 
Площадь зоны роста составляет примерно 20 см2. Если количество колоний превышает 150, то можно примерно оценить численность, используя один или несколько репрезентативных квадратов, определить среднее значение в квадрате. Умножить полученный результат на 20, чтобы получить количество на петрифильме. Для получения точного результата рекомендуется приготовить разведения образца. 

Рис.5. Слишком большое количество для подсчета 
Характерные особенности петрифильма (СС), если количество колоний для подсчета слишком большое: много мелких колоний, много пузырьков газа, сильное потемнение цвета геля.



Рис.6. Количество колоний, продуцирующих газ = 4
При наличии большого количества неколиформных бактерий, таких как Pseudomonas, цвет геля может меняться на желтый. 

Рис.7. Количество колоний, продуцирующих газ = 2 
Частицы образца обычно неправильной формы и не связаны с пузырьками газа.

 

Рис.8. Количество колоний = 8 
Пузырьки могут быть разными. Газ может разрывать колонии, так, что колония как бы очерчивает пузырек. Пузырьки-артефакты могут образоваться в результате неправильного проведения посева или из-за захвата пузырьков образцом. Такие пузырьки имеют неправильную форму и не связаны с колониями. 

Рис.9. Примеры 1-10 на Рис.9
показывают различные образцы пузырьков, связанных с колониями. Все такие примеры учитываются при подсчете. 3М Petrifilm Coliform Count Plate (СС) – Петрифильм для определения колиформных бактерий

3М Petrifilm Coliform Count Plate (СС) – 
Петрифильм для определения колиформных бактерий

   Хранение

Хранить закрытые упаковки петрифильмов при температуре ≤8оС. Использовать петрифильмы до даты, указанной на упаковке. В местах повышенной влажности, где может скапливаться конденсат, перед открытием упаковки следует дождаться, пока петрифильмы нагреются до комнатной температуры.	Для закрытия вскрытой упаковки следует согнуть край и заклеить клейкой лентой.	Храните повторно закрытые упаковки при температуре ≤25оС и влажности ≤50%. Не хранить вскрытые упаковки петрифильмов в холодильнике. После вскрытия упаковки использовать петрифильмы не более одного месяца.

   Подготовка образцов

Приготовить разведение 1:10 или большие разведения образца. Взвесить образец продукта в стерильном пакете, флаконе или другом стерильном контейнере.	Добавить соответствующее количество разбавителя  • фосфатный буфер  • 0,1% пептонная вода  • пептонно-солевая вода (ИСО 6887)  • забуф. пептонная вода (ИСО 6579) • физ.раствор • раствор Рингера  Не использовать буферные р-ры, содержащие цитрат, бисульфит или тиосульфат, которые могут ингибировать рост	Гомогенизировать образец с использованием гомогенизатора, например, Masticator. рН разведенного образца должен быть в диапазоне 6,6-7,2. Использовать 1М NaOH или 1М HCl.

Petrifilm Coliform Count Plate (СС)

   Инокуляция (внесение образца на петрифильм)

Поместить петрифильм на ровную поверхность. Приподнять верхнюю пленку.	Добавить пипеткой 1 мл образца в центр нижней пленки.	Аккуратно опустить верхнюю пленку (прокатывая); избегать захвата пузырьков. Не бросать верхнюю пленку.

Поместить распределитель ровной стороной вниз на верхнюю пленку, накрывая образец.	Мягко надавить на распределитель для равномерного распределения образца по кругу. Не следует крутить или скользить распределителем по петрифильму.	Поднять распределитель. Подождать, как минимум, одну минуту для затвердевания геля.

   Инкубация                                    Учет результатов

Инкубировать петрифильмы прозрачной стороной вверх. Петрифильмы можно складывать в стопки до 20 штук. В термостат можно установить емкость с водой для предотвращения потерь влаги на петрифильмах. Инкубировать в течение 24 ч ± 3 часа при 37±1оС.	Колонии можно учесть с автоматически с использованием считывающего устройства – Petrifilm Plate Reader (PPR) или с помощью счетчика колоний или увеличительного стекла.	Колонии можно изолировать для дальнейшей идентификации. Приподнять верхнюю пленку и отобрать колонию из геля.