Описание
Петрифильм 3M Petrifilm High-Sensitivity Coliform Count (HSCC) – содержит питательную основу среды VRB (кристаллический фиолетовый с желчью), гель, растворимый в холодной воде, который застывает при комнатной температуре, тетразолиевый индикатор, который облегчает подсчет колоний. Петрифильмы (HSCC) используются для подсчета низкой степени микробного загрязнения колиформных бактерий в продуктах, сырье. На петрифильм (HSCC) образец вносится в объеме 5 мл. Это позволяет выявить одну колиформную бактерию в 1 г продукта при разбавлении образца (1:5). При разбавлении образца (1:10) на петрифильме (HSCC) можно выявить 2 колиформные бактерии (или использовать 2 петрифильма).

В соответствии со стандартами АОАС International  и U.S. FDA Bacteriological Analytical Manual (ВАМ) (Руководство по бактериологии) колиформными бактериями являются грамотрицательные палочки, которые ферментируют лактозу с образованием кислоты и газа. Колиформные бактерии на петрифильме (HSCC) образуют кислоту, которая вызывает изменение цвета рН индикатора среды, цвет среды становиться более темным. Наличие красных колоний с пузырьками газа вокруг указывает на их принадлежность к колиформным бактериям.

В соответствии со стандартом ISO колиформные бактерии определяются по их способности к росту на специальных селективных средах. Метод ISO 4832 для подсчета колиформных бактерий определяет колиформы по их способности к образованию кислоты на VRB-агаре с лактозой (VRBL). На петрифильмах Petrifilm (HSCC) колиформы, образующие кислоту, обнаруживаются по красным колониям с газом или без газа. Метод ISO 4831 для подсчета колиформных бактерий методом НВЧ (наиболее вероятных чисел) определяет колиформы по их способности образовывать газ из лактозы на селективном бульоне. На петрифильмах (HSCC) колиформы образуют красные колонии с газом. Организация AFNOR утвердила использование петрифильмов (HSCC) в соответствии со стандартом ISO 4831 для определения количества колиформных бактерий.

Хранение и утилизация
Хранить невскрытые упаковки с петрифильмами следует в холодильнике при температуре 2-8°C. Перед вскрытием упаковки с петрифильмами дать упаковке нагреться до комнатной температуры. Неиспользованные петрифильмы поместить обратно в упаковку. Запечатать упаковку скотчем. Чтобы предотвратить контакт с влагой, не следует хранить открытые упаковки в холодильнике. Хранить вновь запечатанные упаковки в сухом прохладном месте не более одного месяца. Нахождение вскрытых упаковок петрифильмов при температуре более 25°C и/или относительной влажности свыше 50% может повлиять на их эксплуатационные качества. Не использовать петрифильмы, на которых произошло обесцвечивание среды. Срок годности и номер партии указаны на каждой упаковке петрифильмов.

Как и все системы для тестирования микроорганизмов, петрифильмы после использования могут содержать жизнеспособные бактерии, что может представлять потенциальную опасность. Следуйте современным методам инактивации и утилизации биологического материала.

Инструкция использования

Подготовка образца
1. Для разбавления образца использовать 0,1% пептонную воду, забуференную пептонную воду, таблетки Рингера (для приготовления изотонического раствора), физиологический раствор или дистиллированную воду.
Не использовать буферные растворы, содержащие цитрат, бисульфит или тиосульфат, т.к. эти соединения могут ингибировать рост бактерий.
2. Смешать и гомогенизировать образец.
3. Для оптимального роста бактерий довести рН разведенного образца до 6,6–7,2. Для коррекции рН кислых образцов используйте 1 н. NaOH. pH щелочных образцов довести с помощью 1 н. HCl.

Внесение образца
1. Поместить петрифильм (HSCC) на ровную поверхность.
2. Поднять верхнюю пленку и внести 5 мл исходного образца (или его разведения)  на поверхность питательной подложки (в центр) петрифильма.
3. Опустить верхнюю пленку (прокатывая) на образец. Избегать скатывания образца за пределы петрифильма.
4. Поместить пластиковый распределитель в центр петрифильма.
5. Мягко надавить на центр распределителя для равномерного распределения образца. Распределить образец по зоне роста на петрифильме. Не скользить распределителем по пленке!
6. Убрать распределитель и оставить петрифильм на 2-5 минут для затвердевания геля. 

Инкубация
Инкубировать петрифильмы в горизонтальном положении прозрачной стороной вверх. Петрифильмы можно группировать в количестве не более 10 штук. Установить емкость с водой для создания повышенной влажности в термостате. Для выявления и учета колиформных бактерий инкубировать петрифильмы (HSCC) в течение (24±2) часов при (37±1)°C.

Для выявления и учета термотолерантных колиформных бактерий инкубировать в течение (24±2) часов при (44±1)°C

Интерпретация результатов
1) Количество колоний на петрифильмах можно учесть с помощью стандартного счетчика колоний или другого подсвечиваемого увеличителя. Не следует учитывать колонии на пенопластовом ограничителе зоны роста, они лишены селективных условий роста. Не следует учитывать пузырьки-артефакты, которые могут присутствовать на петрифильме. 

Колиформные бактерии образуют колонии красного цвета, которые связаны с образованием пузырьков газа. Колонии, которые не связаны с образованием пузырьков газа, не учитываются как колифомные бактерии. Общее количество колиформных бактерий, включает красные колонии, связанные с образованием газа в течение 24 часов.

2) Зона роста составляет примерно 60см². Можно проводить учет колоний на петрифильмах, если их численность превышает 150 колоний. В этом случае подсчитывают количество колоний в одном или более репрезентативных квадратах и определяют среднее количество колоний в квадрате. Умножив среднее количество колоний на 60, получают число колоний на петрифильме.

3) При большой концентрации колоний на петрифильме может присутствовать: много мелких колоний, много пузырьков газа, потемнение цвета геля из-за подкисления среды. При наличии любого из вышеперечисленных признаков результат фиксируется как «слишком большое количество для подсчета» и следует приготовить дополнительные разведения образца для получения более точного результата.

4) Колонии можно изолировать для дальнейшей идентификации. Для этого следует поднять верхнюю пленку и извлечь колонию из геля. Идентифицировать колонию с использованием стандартных методов.

5) По окончании инкубации петрифильмы можно хранить в морозильнике в течение одной недели при температуре (-15C°) для последующего учета. Проводится в тех случаях, когда нет возможности учесть численность сразу после инкубации. 

3М Petrifilm High-Sensitivity Coliform Count Plate –  Петрифильм высокочувствительный для определения колиформных бактерий в объеме 5 мл  В соответствии со стандартами АОАС International и U.S. FDA Bacteriological Analytical Manual (ВАМ) (Руководство по бактериологии) колиформными бактериями являются грамотрицательные палочки, которые ферментируют лактозу с образованием кислоты и газа. Способность к образованию газа используется для дифференциации колоний колиформных от неколиформных бактерий. Наличие красных колоний с пузырьками газа вокруг указывает на их принадлежность к колиформным бактериям. Продукция кислоты вокруг колоний вызывает изменение цвета рН индикатора и цвет геля становится розово-красным.   Рис.1.  Количество колиформных бактерий = 4  Рис.2.  Количество колиформных бактерий = 13  На петрифильме легко учесть колиформные бактерии. Индикатор окрашивает грамотрицательные колонии в красный цвет, а верхняя пленка задерживает пузырьки газа, образуемые колиформными бактериями. При образовании кислоты колиформами, гель вокруг колоний становится более розовым. Обращайте внимание на розово-красные зоны вокруг колоний для учета колиформных бактерий. Учесть все красные колонии с пузырьками газа как колиформные бактерии.  3М Petrifilm High-Sensitivity Coliform Count Plate   Рис.3. Количество колиформных бактерий = 30  Образование газа используется для дифференциации колиформных бактерий от неколиформных. Примеры образования пузырьков газа вокруг колоний колиформных бактерий – 1, 2 и 3. Красные колонии, которые не связаны с пузырьками газа, не считаются колиформами. Рис.4.  Количество колиформных бактерий = 0  Отметить изменение цвета геля см. рис.4-9. По мере увеличения численности колиформных бактерий и продукции кислоты цвет геля меняется от светло-оранжевого (рис.4) до розово-красного (рис.9). Наличие негативного контроля помогает отмечать изменения цвета геля.  Рис.5.  Количество колиформных бактерий = 90  Рис.6.  Количество колиформных бактерий = 320  Площадь зоны роста на петрифильме составляет 60см2. При количестве колоний на петрифильме более 150 можно примерно оценить численность. Для этого надо подсчитать количество колоний в одном или большем количестве квадратов, определить среднее количество колоний в квадрате. Умножить среднее количество на 60 для определения количества колоний на петрифильме. Рис.7.  Количество колиформных бактерий = 840  По краю зоны роста колонии и пузырьки газа могут быть меньше (рис.7).  Рис.8. Количество = слишком много для подсчета (≥103)  Большое количество колоний вызывает изменение цвета геля до розово-красного (рис.8). Кроме того, можно наблюдать много мелких колоний и/или пузырьков газа. Однако, чем выше численность колиформных бактерий, тем меньше колонии и пузырьки газа. Рис.9. Количество колоний = слишком много для подсчета (≥104)  На рис.9 много мелких колоний и изменение цвета геля до розово-красного. Рис.10.  Количество колоний = 2  Частицы продукта, как правило, неправильной формы и не ассоциированы с пузырьками газа. Пузырьки артефакты происходят из-за неправильной процедуры посева. Такие пузырьки имеют неправильную форму и не связаны с красными колониями. 3М Petrifilm High-Sensitivity Coliform Count Plate    Хранение Хранить закрытые упаковки петрифильмов при температуре ≤8оС. Использовать петрифильмы до даты, указанной на упаковке. В местах повышенной влажности, где может скапливаться конденсат, перед открытием упаковки следует дождаться, пока петрифильмы нагреются до комнатной температуры. Для закрытия вскрытой упаковки следует согнуть край и заклеить клейкой лентой. Храните повторно закрытые упаковки при температуре ≤25оС и влажности ≤50%. Не хранить вскрытые упаковки петрифильмов в холодильнике. После вскрытия упаковки использовать петрифильмы не более одного месяца.    Подготовка образцов Приготовить разведение 1:10 или большие разведения образца. Взвесить образец продукта в стерильном пакете, флаконе или другом стерильном контейнере. Добавить соответствующее количество разбавителя • фосфатный буфер  • 0,1% пептонная вода • пептонно-солевая вода (ИСО 6887)  • забуф. пептонная вода (ИСО 6579)  • физ.раствор • раствор Рингера  Не использовать буферные р-ры, содержащие цитрат, бисульфит или тиосульфат, которые могут ингибировать рост Гомогенизировать образец с использованием гомогенизатора, например, Masticator.  рН разведенного образца должен быть в диапазоне 6,6-7,2. Использовать 1М NaOH или 1М HCl.    Инокуляция (внесение образца на петрифильм) Поместить петрифильм на ровную поверхность. Приподнять верхнюю пленку. Добавить пипеткой 1 мл образца в центр нижней пленки. Пипетку держать перпендикулярно. Отпустить пленку, дать пленке свободно упасть. Не прокатывать верхней пленкой вниз.   Поместить распределитель на верхнюю пленку петрифильма. Мягко надавить на распределитель для равномерного распределения образца по кругу. Не следует крутить или скользить распределителем. Поднять распределитель. Подождать, как минимум, 2-5 минут для затвердевания геля.    Инкубация                             Учет результатов  Инкубировать петрифильмы прозрачной стороной вверх. Петрифильмы можно складывать в стопки до 10 штук. В термостат можно установить емкость с водой для предотвращения потерь влаги на петрифильмах. Инкубировать в течение 24 ч ± 3 часа при 37± 1оС. Колонии можно учесть с помощью счетчика колоний или увеличительного стекла. Колонии можно изолировать для дальнейшей идентификации. Приподнять верхнюю пленку и отобрать колонию из геля.