Описание
3M Petrifilm Rapid Coliform Count (RCC) – экспресс-тесты, которые  включает: готовую питательную среду VRB (агар кристаллический фиолетовый с желчью и лактозой), водорастворимый гель, рН-индикатор для обнаружения кислоты и тетразолиевый индикатор, который облегчает учет колоний. Петрифильмы RCC используются для экспресс подсчета колиформных бактерий в сырье, пищевых продуктах, объектах внешней среды.

Стандарты АОАС International и U.S.FDA Bacteriological Analytical Manual (BAM) определяют колиформные бактерии как грамотрицательные палочки, которые при ферментации лактозы образуют кислоту и газ.

Если рост колоний на петрифильмах RCC сопровождается образованием кислоты, то происходит изменение цвета индикатора с красно-оранжевого на желтый. Изменение цвета индикатора свидетельствует о возможном наличии колиформных бактерий (предварительный результат). Образование газа (пузырьки вокруг колоний) является окончательным подтверждением наличия колиформных бактерий.

В соответствии со стандартом ISO колиформные бактерии определяются по их способности к росту на специальной селективной среде. Метод ISO 4832 для подсчета колиформных бактерий определяет колиформы по их способности к образованию кислоты на VRB-агаре с лактозой (VRBL). На петрифильмах RCC колиформы, образующие кислоту, обнаруживаются по желтым зонам, или красным колониям с газом или без газа. Метод ISO 4831 для подсчета колиформных бактерий методом НВЧ (наиболее вероятных чисел) определяет колиформы по их способности образовывать газ из лактозы на селективном бульоне. На петрифильмах RCC колиформы образуют красные колонии с газом. Организация AFNOR утвердила использование петрифильмов RCC в сравнении со стандартами ISO 4831 и 4832. 

Хранение и утилизация
Хранить невскрытые упаковки с петрифильмами следует в холодильнике при температуре 2-8°C. Перед открытием упаковки с петрифильмами следует подождать, чтобы  упаковка нагрелась до комнатной температуры. Неиспользованные петрифильмы поместить обратно в упаковку. Чтобы предотвратить контакт с влагой, не хранить открытые упаковки с петрифильмами в холодильнике. Хранить вновь запечатанные упаковки в сухом прохладном месте в течение не более одного месяца. Нахождение вскрытых упаковок петрифильмов при температуре более 25°C и/или относительной влажности свыше 50% может повлиять на их качество. Не используйте петрифильмы, на которых заметны следы обесцвечивания. Срок годности и номер партии указаны на каждой упаковке петрифильмов. 

Как и все системы для тестирования микроорганизмов, петрифильмы после использования могут содержать жизнеспособные бактерии. Следуйте стандартам методам инактивации и утилизации биологического материала.

Инструкция по использованию

Подготовка образца
1. Для разбавления образца использовать 0,1% пептонную воду, забуференную петонную воду, физиологический раствор или дистиллированную воду. Не использовать буферные растворы, содержащие цитрат, бисульфит или тиосульфат, т.к. эти соединения могут ингибировать рост бактерий. Смешать и гомогенизировать образец. Для оптимального роста бактерий довести рН разведенного образца до 6–8.

2. Для коррекции рН кислых образцов используйте 1 н. NaOH. pH щелочных образцов довести с помощью 1 н. HCl.

3. Измельчить или гомогенизировать образец. При необходимости приготовить десятикратные разведения образца. Использовать разведение 1:10 для постановки других микробиологических тестов.

Внесение образца
1. Поместить петрифильм RCC на ровную поверхность.
2. Поднять верхнюю пленку и внести 1 мл образца или его разведения на поверхность питательной подложки (в центр) петрифильма RCC.
3. Медленно опустить верхнюю пленку на образец. Избегать захвата пузырьков воздуха.
4. Сразу же поместить пластиковый распределитель в центр петрифильма гладкой стороной вниз.
5. Мягко надавить на центр распределителя для равномерного распределения образца. 
    Не перемещать распределитель по пленке!
6. Убрать распределитель и оставить петрифильм на одну минуту для затвердевания геля.

Инкубация
1. Инкубировать петрифильмы RCC в течение (6-24) часов при (37±1)°C в горизонтальном положении прозрачной стороной вверх. Петрифильмы можно группировать в количестве не более 20 штук. 
2. Установить емкость с водой для создания повышенной влажности в термостате.

Интерпретация и учет результатов
Подсвечивание петрифильмов может ускорить обнаружение желтых зон подкисления на петрифильмах RCC. Колонии колиформных бактерий могут начать появляться уже через 6 часов в виде отдельных желтых зон. Продолжить инкубацию для выявления желтых зон подкисления и/или красных колоний, которые связаны с зонами подкисления. Не учитывать колонии на пенопласте, т.к. они не находятся в селективных условиях. Не следует учитывать пузырьки, которые являются артефактами. Некоторые колиформные бактерии образуют большое количество кислоты. Для таких организмов желтые зоны подкисления могут сливаться при росте около 20 колоний на петрифильме. Площадь роста на петрифильме составляет примерно 20 см². При наличии свыше 50 зон подкисления подсчет можно проводить в одном или нескольких представительных квадратах. Найти среднее значение зон в квадрате. Умножив среднее значение на 20, получаем общее количество зон подкисления на петрифильме. 

Подсчет зон подкисления
- Предварительный учет колиформных бактерий основан на подсчете желтых зон подкисления (с красными колониями или без в центре) и проводится через 6-14 часов в соответствии с ВАМ и АОАС.

- Учет результатов в соответствии с AFNOR проводится через 14 часов ± 30 мин. Колиформные бактерии учитывают по желтым зонам подкисления (с образованием красных колоний или без колоний)

- Для подсчета колоний на петрифильме можно использовать стандартный счетчик колоний или увеличительное стекло. Область роста колоний примерно 20 см². Если количество колоний свыше 150, то для подсчета колоний находят среднее значение и умножают его на 20. 

Подсчет колоний, связанных с образованием газа
- Окончательный учет результатов колиформных бактерий в соответствии со стандартом ВАМ проводится через 8-24 часа и основан на учете красных колоний, образующих газ.
- Учет результатов в соответствии со стандартами ISO 4831, AFNOR проводится через 24±2 часа и основан на учете красных колоний, образующих газ.

Подсчет колоний, связанных с образованием газа или без газа
- Учет результатов в соответствии со стандартами ISO 4832, AFNOR проводится через 24±2 часа и основан на учете красных колоний, образующих или не образующих газ.

- При наличии большого количества колиформных бактерий (свыше 1000 КОЕ/петрифильм), вся зона роста на петрифильме может изменить цвет на желтый уже через 4 часа инкубации! В таком случае готовят серийные разведения образца.

- Колонии можно изолировать для дальнейшей идентификации. Для этого следует поднять верхнюю пленку и извлечь колонию из геля. Идентифицировать колонию с использованием стандартных методов.

3М Petrifilm Rapid Coliform Count Plate (RCC) –  Петрифильм для ускоренного определения колиформных бактерий Через 6 часов Через 14 часов Подсчет колиформных бактерий по зонам подкисления через 6-14 часов Желтые зоны подкисления могут появиться уже через 6 часов инкубации. При наличии колиформных бактерий желтые зоны будут появляться и распространяться в течение периода инкубации. В соответствии с AOAC/ВАМ стандартами • Подсчитать количество желтых зон подкисления с красным центром или без красного центра. Рассматривать полученный результат как предварительный учет колиформных бактерий. В соответствии со стандартом ИСО 4832 (VRBL) • Подсчитать количество желтых зон подкисления с красным центром или без красного центра.  • Результат через 14 часов Подсчет колиформных бактерий через 8-24 часа Красные колонии с газом или без газа могут начать появляться уже через 8 часов инкубации и продолжают расти в течение инкубации. В соответствии с AOAC/ВАМ стандартами  • Учитываются красные колонии, образующие газ – колиформные бактерии  В соответствии с ИСО 4831(НВЧ)  • Учитываются красные колонии, связанные с образованием газа как колиформные бактерии  • Окончательный результат через 24 часа (AFNOR)  В соответствии с ИСО 4832 (VRBL)  • Подсчитать количество красных колоний с газом и без газа, учесть их как колиформные бактерии  • Окончательный результат через 24 часа Подсчет зон подкисления (6-14 часов) Отметить изменения в геле Рис.3-10. Так как колиформные бактерии образуют кислоту, то цвет геля меняется с красно-оранжевого на оранжево-желтый. Высокие концентрации колиформных бактерий (более 100 клеток/петрифильм) могут вызывать полную смену цвета в зоне роста на петрифильме уже после 4 часов инкубации. См. рис.4. Если это происходит, то необходимо сделать разведения образца, для получения точного результата. Некоторые колиформные бактерии сильно подкисляют среду. В таких случаях может происходить распространение кислых зон от 20 колоний на петрифильм. Можно оценить численность при наличии свыше 50 отдельных зон подкисления. Площадь круга зоны роста на петрифильме RCC составляет примерно 20 см2. Можно выбрать представительные квадраты, определить среднее значение колоний в квадрате и умножить его на 20. На рис.5 можно выделить 6 зон подкисления в выбранном квадрате. В процессе роста колиформных бактерий в кислых зонах начинают появляться красные колонии. См. рис.6. Ранний учет роста бактерий на петрифильмах RCC основан учете зон подкисления и образовании газа зависит от метаболической активности клеток и их концентрации.  Подсчет колоний и газа (8-24 часа) На рис. 7 и 8 представлены результаты роста микроорганизмов. Четкие красные колонии с зонами подкисления образуются в обоих случаях. Однако бактерии на рис.8, по-видимому, ферментируют лактозу до газа более активно по сравнению с бактериями на рис.7.  Подсчет колоний с газом или без газа зависит от используемого метода. На рис.9 - пример подсчета колоний с газом или без газа. Результат учета зависит от метода.  Согласно АОАС/ВАМ подтвержденные колиформы – колонии с газом = 72 Согласно ИСО 4831 колиформы – колонии, которые образуют газ = 72 Согласно ИСО 4832 колиформы – колонии с газом или без газа = 128  Если количество колоний превышает 150 на петрифильм, то можно примерно оценить количество. Не следует учитывать колонии, которые вырастают на ограничивающем пенопласте, т.к. условия роста там неселективные. См. рис.7-10. Слишком большое количество колоний для подсчета  (свыше 1000 колоний/петрифильм) Если количество колоний слишком большое для подсчета, то петрифильм RCC имеет следующие особенности: цвет геля меняется с красно-оранжевого на оранжево-желтый, может присутствовать много мелких колоний или много пузырьков газа. См. рис.11. На рис.12 гель изменил цвет и присутствует много мелких колоний На рис.13 количество колоний настолько большое, что отдельных колоний не видно. Изменение цвета геля и наличие большого количества пузырьков указывает на слишком большое количество колоний. На рис.14 присутствует большое количество грамотрицательных колоний неколиформных бактерий. Если присутствует большое количество бактерий, которые не ферментируют лактозу, то цвет геля может меняться на темно-красный.   рН   Для большинства бактерий оптимальным для роста значением рН является около 7,0. Приготовление разведений продуктов с низким значением рН иногда требует доведения рН до 6,5-7,5 перед посевом на петрифильм. На рис. 15 и 16 приведены примеры посевы свежего йогурта после подведения рН. Ингибиторы, присутствующие в среде препятствуют росту грам-положительных бактерий стартовой культуры, однако кислота, образуемая стартовой культурой, может изменить цвет геля с красно-оранжевого на оранжево-желтый, что делает результат похожим на наличие большого количества колиформных бактерий. Образцы, содержащие свежие стартовые культуры йогурта следует контролировать на наличие других признаков наличия роста колиформных бактерий. Сравните эти отрицательные результаты с отрицательными результатами, полученными на рис. 14. Отметьте отсутствие колоний или пузырьков газа на рис.15. Несмотря на изменение цвета геля, кислота, образуемая колиформными бактериями все еще хорошо видна. Рис.16. Продукт Частицы продукта имеют часто неправильную форму и не связаны с пузырьками газа На рис.17 показан предварительный учет результатов образца паприки. Пример 1 показывает кислую зону вокруг красной, неправильной формы частицы. Некоторые продукты могут содержать кислые включения, которые вызывают изменения цвета рН индикатора. Пример 2 – наличие пузырька вокруг красной неправильной формы частички продукта, однако кислая зона отсутствует. Ни тот, ни другой случай не учитываются. На Рис. 18 представлен образец шоколада в разведении. Зоны подкисления, связанные с колониями, расширяются в процессе инкубации. Пузырьки газа, связанные с колониями, являются другим критерием принадлежности к колиформным бактериям. Поместить петрифильм на ровную поверхность. Приподнять верхнюю пленку. Добавить пипеткой 1 мл образца в центр нижней пленки. Аккуратно опустить верхнюю пленку (прокатывая); избегать захвата пузырьков. Не бросать верхнюю пленку.   Ровной стороной вниз поместить распределитель на верхнюю пленку, накрывая образец. Мягко надавить на распределитель для равномерного распределения образца по кругу. Не следует крутить или скользить распределителем. Поднять распределитель. Подождать, как минимум, одну минуту для затвердевания геля.   Инкубировать петрифильмы прозрачной стороной вверх в стопке до 20 штук при температуре 37 ±1оС в течение 24 ± 2 часа. Предварительный результат можно учитывать уже через 6-8 часов. Учесть результаты, используя непрямой свет. Колонии можно учесть с использованием увеличительного стекла или счетчика колоний. Колонии можно изолировать для дальнейшей идентификации. Приподнять верхнюю пленку и отобрать колонию из геля.