Описание
Петрифильм 3M Petrifilm Yeast and Mold (YM) – содержит питательную среду c антибактериальным антибиотиком, гель, растворимый в холодной воде, который застывает при комнатной температуре, индикатор, который облегчает подсчет колоний дрожжей и плесневых грибов. Петрифильмы (YM) используются для подсчета дрожжей и плесневых грибов в продуктах, сырье, а также при производстве безалкогольных напитков. 

Хранение и утилизация
Хранить невскрытые упаковки с петрифильмами следует в холодильнике при температуре 2-8°C. Перед вскрытием упаковки с петрифильмами дать упаковке нагреться до комнатной температуры. Неиспользованные петрифильмы поместить обратно в упаковку. Запечатать упаковку скотчем. Чтобы предотвратить контакт с влагой, не следует хранить открытые упаковки в холодильнике. Хранить вновь запечатанные упаковки в сухом прохладном месте не более одного месяца. Нахождение вскрытых упаковок петрифильмов при температуре более 25°C и/или относительной влажности свыше 50% может повлиять на их эксплуатационные качества. Не использовать петрифильмы, на которых произошло обесцвечивание среды. Срок годности и номер партии указаны на каждой упаковке петрифильмов.

Как и все системы для тестирования микроорганизмов, петрифильмы после использования могут содержать жизнеспособные бактерии, что может представлять потенциальную опасность. Следуйте современным методам инактивации и утилизации биологического материала.

Инструкция использования

Подготовка образца
1. Для разбавления образца использовать 0,1% пептонную воду, забуференную пептонную воду, таблетки Рингера, физиологический раствор или дистиллированную воду. 
Не использовать буферные растворы, содержащие цитрат, бисульфит или тиосульфат, т.к. эти соединения могут ингибировать рост бактерий.
2. Смешать и гомогенизировать образец.
3. Для оптимального роста бактерий довести рН разведенного образца до 6,6–7,2. Для коррекции рН кислых образцов используйте 1 н. NaOH. pH щелочных образцов довести с помощью 1 н. HCl.

Внесение образца
1. Поместить петрифильм Petrifilm Yeast and Mold (YM) на ровную поверхность.
2. Поднять верхнюю пленку и внести 1 мл разведенного образца на поверхность питательной подложки (в центр) петрифильма Petrifilm Yeast and Mold (YM).
3. Опустить верхнюю пленку (прокатывая) на образец. Избегать захвата пузырьков воздуха.
4. Сразу же поместить пластиковый распределитель в центр петрифильма. Мягко надавить на центр распределителя для равномерного распределения образца. Не скользить распределителем по пленке.
5.Убрать распределитель и оставить петрифильм на одну минуту для затвердевания геля. 

Инкубация
Инкубировать петрифильмы в горизонтальном положении прозрачной стороной вверх. Петрифильмы можно группировать в количестве не более 20 штук. Инкубировать петрифильмы при (25±1)°C в течение (72±2) часов (предварительный ответ) и до 120 часов (окончательный ответ). Установить емкость с водой для создания повышенной влажности в термостате. 

Интерпретация
1. Количество колоний на петрифильмах можно учесть с помощью стандартного счетчика колоний или другого подсвечиваемого увеличителя. 

2. Для дифференциации колоний дрожжей и плесневых грибов на петрифильмах Petrifilm Yeast and Mold (YM) учесть следующие морфологические характеристики колоний:

3. Предварительные результаты учитываются на 3 день и окончательные на 5 день. 

4. Колонии плесневых грибов могут занимать всю зону роста на петрифильме, при этом зона роста становится синей, черной или желтой (в зависимости от цвета колоний)

5. При большом количестве колоний дрожжей вся зона роста или ее край на петрифильме становится синего цвета. При кажущемся отсутствии роста на петрифильме, следует приподнять верхнюю пленку и проверить наличие мелких колоний в геле. При наличии большого количества дрожжей можно увидеть в геле белые колонии. Результат записывается как слишком большое количество колоний для подсчета.

6. Зона роста составляет примерно 30 см². Можно проводить учет колоний на петрифильмах, если их численность превышает 150 колоний. В этом случае подсчитывают количество колоний в одном или более репрезентативных квадратах и определяют среднее количество колоний в квадрате. Умножив среднее количество колоний на 30, получают число колоний на петрифильме.

7. Для получения более точного результата следует приготовить дополнительные разведения образца.

8. Для облегчения учета дрожжей и плесневых грибов на петрифильме Yeast and Mold (YM) в качестве индикатора используется наличие фермента фосфатазы. Все живые клетки содержат фосфатазу, поэтому фосфатаза самого образца может вызывать:

   - Синее окрашивание зоны посева на петрифильме (стартовые культуры)
   - Игольчатые пятна интенсивного синего цвета (специи)

9. Отличить фосфатазу образца от фосфатазы дрожжей и плесневых грибов можно если:
    - Приготовить дальнейшие разведения образца
    - Дать крупным частицам образца осесть, затем проводить посев на петрифильм
    - Проверить чашки после 24-48 часов инкубации, отметить любое наличие цвета, если
      интенсивность цвета не изменилась в течение 3 дней инкубации, то цвет может быть вызван
      фосфатазой образца.

10. При необходимости колонии можно изолировать для дальнейшей идентификации. Для этого следует поднять верхнюю пленку и извлечь колонию из геля. Идентифицировать колонию с использованием стандартных методов.

11. По окончании инкубации петрифильмы можно хранить в морозильнике в течение одной недели при температуре (-15C°) для последующего учета. Проводится в тех случаях, когда нет возможности учесть численность сразу после инкубации.

Интерпретация результатов

3М Petrifilm Yeast and Mould Count Plate – 
Петрифильм для определения дрожжей и плесневых грибов

Petrifilm Yeast and Mould (YM) – петрифильм для количественного определения дрожжей и плесневых грибов содержит водорастворимый гель, который желирует при комнатной температуре, питательные вещества, цветной индикатор, который обеспечивает контрастность и облегчает учет результатов.

 

Рис.1 
Общая численность дрожжей и плесневых грибов = 20 Дрожжи = 16, Плесневые грибы = 4 

Петрифильмы содержат как дрожжи, так и плесневые грибы 

3М Petrifilm Yeast and Mould Count Plate

 

Рис.2. 
Дрожжи и плесневые грибы = 0 

Рис.3. Вычисленное количество дрожжей и плесневых грибов = 500 Вычисленное количество дрожжей = 480 Вычисленное количество плесеней = 21 При количестве колоний более 150, можно примерно оценить численность. Для этого надо определить количество колоний на (1 см2) и умножить на 30 для получения общего количества на петрифильме. Площадь посева составляет примерно 30 см2. Колонии дрожжей могут варьировать по цвету от желто-коричневого (как в данном примере) до розового и сине-зеленого.



Рис.4. 
Количество дрожжей - слишком большое для подсчета (свыше 104) Небольшие голубые колонии лучше видны по краю петрифильма (выделенный прямоугольник), хотя присутствуют по всему петрифильму.

Рис.5. Количество плесневых грибов (вычисленное) - 64 Колонии плесеней начинают разрастаться и перекрывать друг друга по всему петрифильму. Подсчитать количество колоний по их границам или по центрам. Петрифильм может быть условно разделен на участки для подсчета колоний. В данном примере выделена примерно ¼ часть петрифильма, на которой ведется подсчет (16 колоний). Затем полученное количество умножается на 4 для получения вычисленного значения на петрифильме. 

 

Рис.6а. 
На рис.6а и 6b представлен один и тот же образец. 
На рис.6a (слишком большое количество плесеней для подсчета) представлен образец в разведении (1:10). Присутствует много мелких, едва различимых колоний, подсчет затруднителен. Рост микроорганизмов в конкурентных условиях подавлен. Для таких образцов рекомендуется делать разведения. 
На рис.6b (количество плесеней 64) представлен тот же образец, но в разведении (1:100), можно легко учесть отдельные колонии. 

Фосфатазная реакция

 

Рис.7.
Дрожжи и плесени = 0 

Рис.8. 
Дрожжи и плесени = 0 Петрифильм Petrifilm YM использует в своем составе индикаторную краску на присутствие фосфатазы. Поэтому, если некоторые продукты содержат фосфатазную активность, то это может вызывать появление синего окрашивания петрифильма. Встречается, как правило, два типа реакции: однородное синее окрашивание фона или интенсивные синие пятна. На рис.7 представлено однородное синее окрашивание, на рис.8 показаны синие пятна, которые часто можно встретить при исследовании специй и гранулированных продуктов. На рис.8 также видны частички продукта, которые проявляют фосфатазную активность. 

Для уменьшения фосфатазной реакции можно использовать один из следующих приемов: 
   1. Разбавить образец. Дальнейшие разведения образца сводят к минимуму окрашивание фона и уменьшают количество интенсивных синих пятен. 
   2. Пробоподготовка. Гомогенизировать образец, дать отстояться 3-5 минут перед посевом. Используйте пакеты с фильтром, чтобы избежать захват крупных частиц продукта. 
   3. Проверка. Наблюдать результаты посева через 24-36 ч после посева, отмечать изменение цвета для правильной интерпретации результатов.

   Хранение

Хранить закрытые упаковки петрифильмов при температуре ≤8оС. Использовать петрифильмы до даты, указанной на упаковке. В местах повышенной влажности, где может скапливаться конденсат, перед открытием упаковки следует дождаться, пока петрифильмы нагреются до комнатной температуры.	Для закрытия вскрытой упаковки следует согнуть край и заклеить клейкой лентой.	Храните повторно закрытые упаковки при температуре ≤25оС и влажности ≤50%. Не хранить вскрытые упаковки петрифильмов в холодильнике. После вскрытия упаковки использовать петрифильмы не более одного месяца.

   Подготовка образцов

Приготовить разведение 1:10 или большие разведения образца. Взвесить образец продукта в стерильном пакете, флаконе или другом стерильном контейнере.	Добавить соответствующее количество разбавителя • фосфатный буфер  • 0,1% пептонная вода  • пептонно-солевая вода (ИСО 6887)  • забуф. пептонная вода (ИСО 6579)  • физ.раствор • раствор Рингера  Не использовать буферные р-ры, содержащие цитрат, бисульфит или тиосульфат, которые могут ингибировать рост	Гомогенизировать образец с использованием гомогенизатора, например, Masticator.  рН разведенного образца должен быть в диапазоне 6,6-7,2. Использовать 1М NaOH или 1М HCl.

   Инокуляция (внесение образца на петрифильм)

Поместить петрифильм на ровную поверхность. Приподнять верхнюю пленку.	Добавить пипеткой 1 мл образца в центр нижней пленки.	Аккуратно опустить верхнюю пленку (прокатывая); избегать захвата пузырьков. Не бросать верхнюю пленку.

Поместить распределитель на верхнюю пленку петрифильма, накрывая образец.	Мягко надавить на распределитель для равномерного распределения образца по кругу. Не следует крутить или скользить распределителем по петрифильму.	Поднять распределитель. Подождать, как минимум, одну минуту для затвердевания геля.

   Инкубация                             Учет результатов 

Инкубировать петрифильмы прозрачной стороной вверх. Петрифильмы можно складывать в стопки до 20 штук. В термостат можно установить емкость с водой для предотвращения потерь влаги на петрифильмах. Инкубировать в течение 3-5 дней при 20-25оС.	Колонии можно учесть с помощью счетчика колоний или увеличительного стекла.	Колонии можно изолировать для дальнейшей идентификации. Приподнять верхнюю пленку и отобрать колонию из геля.

Морфология колоний
 
 

Дрожжи = 43  • Небольшой размер колоний  • Колонии с четкими краями  • Цвет колоний может меняться от   желто-коричневого до сине-зеленого  • Колонии как правило выпуклые  • Колонии равномерно окрашены  • Нет фокуса в центре колоний	Плесени = 29  • Размер колоний большой  • Колонии имеют диффузный край • Цвет колоний может варьировать (коричневый, бежевый, оранжевый, сине-зеленый)  • Колонии плоские  • Колонии обычно имеет фокус в центре

Микроскопия дрожжей и плесневых грибов 
  

Чтобы взять изолированную колонию для дальнейшей идентификации следует приподнять верхнюю пленку петрифильма и взять колонию петлей.	Нанести каплю стерильной воды на предметное стекло и перемешать с колонией. Накрыть покровным стеклом и изучить морфологию клеток под микроскопом.	Типичные клетки дрожжей имеют овальную форму и могут образовывать почки.	Типичные клетки плесеней – это разветвленные гифы (мицелий).	На данном рисунке показаны различные стадии прорастания плесеней.