12. Выявление и определение БГПК, Е.coli

  • 12.1. Выявление и определение количества колиформных бактерий (БГКП)
  • 12.2. Выявление и определение количества бактерий вида Escherichia coli
  • 12.3. Одновременное выявление и определение количества колиформных бактерий (БГКП) и E.coli
12.1. Выявление и определение количества колиформных бактерий (БГКП)

12.1.1. Для выявления и определения количества колиформных бактерий (БГКП) применяется тип петрифильма – «3М™ Petrifilm™ Coliform Count Plate (СС)». Петрифильм (CC) содержит среду VRB (кристаллический фиолетовый с желчью), рН-индикатор для обнаружения кислоты и тетразолиевый индикатор, который окрашивает колонии микроорганизмов в красный цвет и облегчает подсчет колоний. При ферментации лактозы происходит изменение цвета среды вокруг колоний за счет содержащегося в среде рН-индикатора. Образующийся при ферментации лактозы газ задерживается верхней пленкой петрифильма и скапливается вокруг колоний. Наличие газа вокруг колоний при ферментации лактозы является важным биохимическим признаком колиформных бактерий.

12.1.2. Методы отбора проб по п. 7.

12.1.3. Подготовка образца к испытанию по п. 8.

12.1.4. Подготовка петрифильмов к испытанию по п. 9.

12.1.5. Порядок проведения испытания.

12.1.5.1. Петрифильм помещают на ровную поверхность. Приподнимают верхнюю пленку петрифильма.

12.1.5.2. Из исследуемого образца или его соответствующего разведения, приготовленного по п.12.1.3, отбирают пробу объемом  (1,0±0,1) см3 и вносят на поверхность подложки в центр петрифильма.  Аккуратно опускают верхнюю пленку петрифильма, избегая захвата пузырьков воздуха.

12.1.5.3. Помещают пластиковый распределитель в центр петрифильма плоской стороной вниз (выемкой вверх). Мягко надавливают на центр распределителя для равномерного распределения образца. Не следует перемещать или крутить распределитель по петрифильму!

12.1.5.4. Распределитель убирают и петрифильм оставляют на 1-2 минуты для затвердевания геля.

12.1.5.5. Посевы инкубируют при температуре (37±1)°C в течение (24±2) часа. Петрифильмы инкубируют в горизонтальном положении прозрачной стороной вверх при повышенной влажности. Допускается размещать петрифильмы друг на друга по 20 штук.

12.1.6. Обработка результатов.

12.1.6.1. После инкубирования посевов по п.12.1.5.5 подсчитывают на петрифильме  количество  колоний колиформных бактерий. Колиформные бактерии на петрифильмах образуют колонии красного цвета с пузырьками газа вокруг колоний. Подсчитывают количество красных колоний, которые связаны с пузырьками газа визуально или автоматически с помощью Петрифильм-Ридера (3М™ Petrifilm™ Plate Reader).

12.1.6.2. Для подсчета отбирают петрифильмы, на которых выросло от 15 до 150 колоний. Полученный результат умножают на величину  соответствующего разведения и получают количество колиформных бактерий (БГКП) в 1,0 см3 (г) образца.

12.1.6.3. Результат исследований округляют и записывают по ГОСТ 26670.

12.1.6.4. При необходимости колонии могут быть изолированы для дальнейшей идентификации по ГОСТ Р 52816 и ГОСТ 30726.

Примечание.
Не учитывают колонии, выросшие на пенопластовом ограничителе зоны роста.

Если на петрифильме отмечается окрашивание всей зоны роста в темно-красный цвет (из-за большого числа колоний), то для получения количественного  результата готовят разведения образца и заново проводят анализ. 

12.2. Выявление и определение количества бактерий вида Escherichia coli

12.2.1. Для выявления и определения количества Escherichia coli  в анализируемых образцах применяется тип петрифильма – «3М™ Petrifilm™ Select E.coli Count Plate (SEC)». Петрифильм (SEC) содержит хромогенный субстрат (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронид) для выявления специфического фермента, продуцируемого Eoli - β-глюкуронидазы. Данный фермент расщепляет хромогенный субстрат с образованием окрашенных продуктов реакции, в результате чего колонии E.coli приобретают зеленый цвет. Рост при температуре (42±1)°C создает дополнительные селективные условия для выявления термотолерантных микроорганизмов, в том числе E.coli. Газ, образующийся при ферментации лактозы, скапливается вокруг колоний E.coli и является дополнительным диагностическим признаком.

12.2.2. Методы отбора проб по п. 7

12.2.3. Подготовка образца к испытанию по п. 8

12.2.4. Подготовка петрифильмов к испытанию по п. 9

12.2.5. Порядок проведения испытания

12.2.5.1.   Петрифильм помещают на ровную поверхность. Приподнимают верхнюю пленку.

12.2.5.2.   Из исследуемого образца или его соответствующего разведения, приготовленного по п.12.2.3, отбирают пробу объемом (1,0±0,1) см3 и вносят на поверхность подложки в центр петрифильма. Аккуратно опускают верхнюю пленку петрифильма, избегая захвата пузырьков воздуха.

12.2.5.3.   Помещают пластиковый распределитель в центр петрифильма плоской стороной вниз (выемкой вверх). Мягко надавливают на центр распределителя для равномерного распределения образца. Не следует перемещать или крутить распределитель по петрифильму!

12.2.5.4.   Убирают распределитель и оставляют петрифильм на 1-2 минуты для затвердевания геля.

12.2.5.5.   Посевы инкубируют при температуре (42±1)°C в течение (24±2) часов в горизонтальном положении прозрачной стороной вверх в условиях повышенной влажности. Допускается размещать петрифильмы друг на друга по 20 штук.

12.2.6. Обработка результатов

12.2.6.1.   После инкубирования посевов по п.12.2.5.5 на петрифильме учитывают количество колоний зеленого цвета (от темно-зеленого до голубовато-зеленого) с пузырьками газа (или без) вокруг колоний.

12.2.6.2.   Для подсчета отбирают петрифильмы, на которых выросло от 15 до 150 колоний. Полученный результат умножают на величину соответствующего разведения и получают количество колоний E.coli в 1,0 см3 (г) образца.

12.2.6.3.   Результат исследований округляют и записывают по ГОСТ 26670.

12.2.6.4.   При необходимости колонии могут быть изолированы для дальнейшей идентификации по ГОСТ Р 52816 и ГОСТ 30726.

Примечание.
Не учитывают колонии, выросшие на пенопластовом ограничителе зоны роста.

При наличии большого количества мелких колоний на петрифильме для получения количественного результата готовят разведения образца и заново проводят анализ. 

12.3. Одновременное выявление и определение количества E.coli и колиформных бактерий (БГКП)

12.3.1. Для одновременного выявления и определения количества Escherichia coli и колиформных бактерий применяется тип петрифильма  «3М™ Petrifilm™ E.coli/Coliform Count (ЕС)». Петрифильм (ЕС) содержит питательную основу среды VRB (кристаллический фиолетовый с желчью), а также хромогенный субстрат (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-глюкуронид) для выявления специфического фермента, продуцируемого Eoli - β-глюкуронидазы. Данный фермент расщепляет хромогенный субстрат с образованием окрашенных продуктов реакции, в результате чего колонии E.coli приобретают синий цвет. Среда содержит тетразолиевый индикатор, в результате чего колонии колиформных бактерий окрашиваются в красный цвет. Образующийся при ферментации лактозы газ задерживается верхней пленкой петрифильма и скапливается вокруг колоний. Наличие газа вокруг колоний при ферментации лактозы является важным биохимическим признаком колиформных бактерий.

12.3.2. Методы отбора проб по п. 7.

12.3.3. Подготовка образца к испытанию по п. 8.

12.3.4. Подготовка петрифильмов к испытанию по п. 9.

12.3.5. Порядок проведения испытания.

12.3.5.1. Петрифильм помещают на ровную поверхность. Приподнимают верхнюю пленку.

12.3.5.2. Из исследуемого образца или его соответствующего разведения, приготовленного по п.12.3.3, отбирают пробу объемом (1,0±0,1) см3 и вносят на поверхность подложки в центр петрифильма. Аккуратно опускают верхнюю пленку петрифильма, избегая захвата пузырьков воздуха.

12.3.5.3. Помещают пластиковый распределитель в центр петрифильма плоской стороной вниз (выемкой вверх). Мягко надавливают на центр распределителя для равномерного распределения образца. Не следует перемещать или крутить распределитель по петрифильму!

12.3.5.4. Убирают распределитель и оставляют петрифильм на 1-2 минуты для затвердевания геля.

12.3.5.5. Для определения колиформных бактерий (БГКП) посевы инкубируют при температуре (37±1)°C в течение (24±2) часов в горизонтальном положении прозрачной стороной вверх в условиях повышенной влажности. Для определения E.coli инкубацию продлевают до (48±4) часов. Допускается размещать петрифильмы друг на друга по 20 штук.

12.3.6. Обработка результатов

12.3.6.1. После инкубирования посевов по п. 12.3.5.5 на петрифильме учитывают количество колоний визуально или автоматически (с помощью Петрифильм-Ридера – 3М™ Petrifilm™  Plate Reader). Колиформные бактерии образуют колонии красного цвета, а E.coli - колонии синего цвета, а с пузырьками газа вокруг колоний. Для учета E.coli подсчитывают количество синих колоний с пузырьками газа. Общее количество колиформных бактерий включает как красные, так и синие колонии, связанные с образованием газа в течение 24-48 часов.

12.3.6.2. Для подсчета отбирают петрифильмы, на которых выросло от 15 до 150 колоний. Полученный результат умножают на величину соответствующего разведения и получают количество колоний E.coli в 1,0 см3 (г) образца.

12.3.6.3. Результат исследований округляют и записывают по ГОСТ 26670.

12.3.6.4. При необходимости колонии могут быть изолированы для дальнейшей идентификации по ГОСТ Р 52816 и ГОСТ 30726.

Примечание.
Не учитывают колонии, выросшие на пенопластовом ограничителе зоны роста.

При окрашивании зоны роста петрифильма в синий или красный цвет либо при  потемнении цвета геля (большое число колоний E.coli или колиформных бактерий) для получения количественного результата готовят разведения образца и заново проводят анализ.