Pfannebecker J., Becker B.
Университет прикладных наук, Институт пищевых технологий, Lemgo, Германия
 |
В исследовании представлены результаты оценки молекулярного метода обнаружения патогенов в пищевых продуктах с использованием 3М Системы молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) в сравнении со стандартными методами выявления Salmonella enteritidis (ISO 6579) и Listeria monocytogenes (ISO 11290-1). Основой молекулярного метода 3М Системы молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) является сочетание методик изотермической амплификации ДНК и биолюминесцентной детекции после этапа обогащения микроорганизмов. Использование изотермической амплификации ДНК в комбинации с биолюминесцетной детекцией обеспечивает высокую чувствительность метода. Общее время анализа на 3М Системе молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection Systerm) составляет 75 мин, время обогащения образца – 18-48 ч. Общее количество естественно и искусственно загрязненных сальмонеллами и листериями образцов составило 155 (мясо, деликатесы, специи, какао-порошок, сухое молоко). За исключением анализа смеси специй, никаких различий по результатам анализа метода с использованием 3М Системы молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) и стандартными методиками не выявлено.
Введение
3М Система молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) – это система молекулярного обнаружения патогенов - Salmonella, Listeria monocytogenes, E.coli О157:Н7. Система разработана для выявления бактерий в различных пищевых продуктах, таких как мясо, полуфабрикаты, готовая продукция, фрукты, овощи, корма для животных и образцы смывов с поверхности. В данном исследовании приведены результаты выявления патогенов в образцах мяса, деликатесов, специй, сухого молока и какао-порошка с использованием 3М Системы молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System).
Материалы и методы
155 образцов (72 естественно и 83 искусственно (102 КОЕ/г) загрязненных патогенами) исследовались на содержание Salmonella enteritidis (DIN EN ISO 6579) и Listeria monocytogenes (DIN EN ISO 11290-1) – Табл. 1.
Таблица 1. Количество образцов продуктов, исследованных на наличие патогенов
Продукты
|
Salmonella
|
Listeria
|
Мясо птицы
|
16 (3)*
|
15 (3)
|
Маринованное мясо птицы
|
4
|
4
|
Специи (смесь специй)
|
25 (16)
|
25 (16)
|
Деликатесы
|
24 (14)
|
24 (14)
|
Мясной фарш
|
4 (3)
|
4 (3)
|
Сухое молоко
|
2 (2)
|
3 (3)
|
Какао-порошок
|
3 (3)
|
3 (3)
|
Количество образцов
|
77 (41)
|
78 (42)
|
Общее количество анализов
|
174
|
172
|
*В скобках указано количество искусственно загрязненных образцов
|
Обогащение образцов, а также анализ на 3М Системе молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) выполняли в двух повторностях. После этапа обогащения (18 ч) образцы анализируются на автоматическом устройстве в реальном времени в течение 75 минут. Прибор прост в эксплуатации, подготовка образца включает всего несколько этапов (рис. 2).
3М Система молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System), методика:
1) Обогащение образца. Образец продукта + обогатительный бульон (1:10), инкубировать при 37 оС, 18-48 ч.
2) Лизис клеток. Внести 20 мкл обогащенного образца в пробирку для лизиса, нагреть при 100оС 15 мин, охладить 10 мин, встряхнуть 3-5 раз, оставить на 5 мин.
3) Гидратирование реагентов. Внести 20 мкл лизата в реагентную пробирку с лиофилизованными реактивами.
4) Амплификация и детекция. Поместить пробирки в прибор и нажать кнопку «старт»; продолжительность амплификации 75 мин. Результаты в виде цветных кривых отображаются на экране в режиме реального времени.
Общее время исследования сальмонелл молекулярным методом с использованием 3М Системы молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) составляет менее 20 ч, что в 4,5 раза быстрее по сравнению с классическим методом (DIN EN ISO) (90-96 ч).
Результаты
Опыты с искусственно зараженными образцами показали, что даже при низком содержании клеток (102 КОЕ/г) при 18 ч обогащении положительный результат регистрируется уже через 20-30 мин после начала амплификации (рис.3). Каких-либо различий в выявлении сальмонелл и листерий в мясе, салатах, сухом молоке и какао-порошке при сравнении результатов 3М Системы молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) и классического метода (DIN EN ISO) не выявлено. Различия между методами выявлены при исследовании смеси специй (табл. 2).
Продукт
|
Salmonella
|
Listeria
|
Кол-во анализов
|
Отклонение MDS+ ISO-
|
Отклонение MDS- ISO+
|
Кол-во анализов
|
Отклонение MDS+ ISO-
|
Отклонение MDS- ISO+
|
Мясо птицы
|
28
|
0
|
0
|
30
|
0
|
0
|
Маринованное мясо
|
8
|
0
|
0
|
8
|
0
|
0
|
Специи (смесь специй)
|
37
|
0
|
2
|
37
|
1
|
3
|
Салаты
|
34
|
0
|
0
|
34
|
0
|
0
|
Мясной фарш
|
8
|
0
|
0
|
8
|
0
|
0
|
Сухое молоко
|
2
|
0
|
0
|
1
|
0
|
0
|
Какао-порошок
|
3
|
0
|
0
|
4
|
0
|
0
|
Всего:
|
120
|
0
|
2
|
122
|
1
|
3
|
При анализе смеси специй (сельдерей, горчица, перец) с использованием 3М Системы молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) (в сравнении с ISO) получили ложноотрицательный результат. В дальнейшем при анализе специй после разбавления образцов (1:100) и последующем проведении этапа обогащения все загрязненные образцы (102 КОЕ/г) были оценены как положительные (данные не приведены).
В опытах по выявлению предела обнаружения бактерий на 3М Системе молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) в мясе и деликатесах показано, что выявление микроорганизмов в этих продуктах без этапа обогащения возможно лишь при исходной концентрации бактерий свыше 105 КОЕ/г. Таким образом, достоверные результаты по выявлению патогенов можно получить лишь после 18 ч этапа обогащения образцов.
Результаты с использованием 3М Системы молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) молекулярного обнаружения патогенов сравнивали со стандартными методами DIN EN ISO. Точность полученных результатов в опытах с сальмонеллой составила 98%, специфичность 100% , а чувствительность 96%; для листерии, точность - 96%, специфичность – 98% и чувствительность - 95%.
Заключение
При сравнении со стандартным методом DIN EN ISO молекулярный метод с использованием 3М Системы молекулярного анализа (3M™ Molecular Detection System) показал достоверные результаты при сокращении времени исследования при анализе Listeria monocytogenes и Salmonella enteritidis. Ложноотрицательные результаты при анализе специй можно избежать, изменив этап подготовки образцов.